Western-blot 實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟及試劑選擇指南

Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測(cè)蛋白的常用的方法之一。本文分別介紹western 的實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟以及試劑選擇指南。  

實(shí)驗(yàn)原理：

Western技術(shù)是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳后，經(jīng)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.收集蛋白樣品

用適當(dāng)?shù)牧呀庖禾幚碣N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。某些特定組分的蛋白的蛋白抽提，請(qǐng)欣博盛為您查詢。  

收集完蛋白樣本后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。 

2. 電泳

2.1 SDS-PAGE凝膠配置

2.2 樣本處理

在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。

2.3 上樣與電泳

冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小。

通常電泳時(shí)溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白已經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。

3. 封閉

轉(zhuǎn)膜完畢后，立即將蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分鐘，以洗掉膜上的轉(zhuǎn)膜液。吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉60分鐘。對(duì)于一些背景較高的抗體，4℃封閉過夜。

4. 一抗孵育

吸盡封閉液，加入稀釋好的一抗，室溫?fù)u床上孵育1小時(shí)或者4℃孵育過夜。Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對(duì)照。通常選用Tubulin或Actin抗體，進(jìn)行內(nèi)參檢測(cè)。

一抗欣博盛推薦Genetex抗體，GeneTex抗體所含蓋的領(lǐng)域從神經(jīng)學(xué)、血液血管學(xué)、免疫學(xué)、代謝機(jī)制、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、干細(xì)胞研究、老化、遺傳學(xué)、感染疾病診斷與研究，乃于斑馬魚模式動(dòng)物抗體等，并提供完善的客制化抗體制備服務(wù)。目前該公司擁有的抗體總數(shù)已逾55,000種，而且每月仍有近百種新型抗體推出。其中，以小鼠單株抗體與兔多株抗體為該公司質(zhì)量與價(jià)格優(yōu)勢(shì)的產(chǎn)品。鏈接如下：www.genetex。。ｃｏｍ。有詳細(xì)的各個(gè)領(lǐng)域的研究資料。

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5. 二抗孵育

吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或者4℃搖床上孵育1小時(shí)。SouthernBiotech能夠提供多種不同標(biāo)記的二抗。 

6. 蛋白檢測(cè)

6.1 ECL化學(xué)發(fā)光，顯影，定影

將A和B兩種試劑在離心管中等體積混勻；1 min后，將溶液平鋪在膜蛋白面，暗室反應(yīng)2min后去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。在暗室中顯影定影。

6.2 凝膠圖像分析

將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶和內(nèi)參條帶的凈光密度值以及他們的比值。