穩定轉染細胞系的建立

本文主要介紹穩定轉染的原理、步驟，穩定轉染能夠得到穩定高表達的細胞株，是滿足活性蛋白大量制備的方法。

利用哺乳動物系統生產蛋白的方式有兩種：瞬時轉染和穩定轉染。使用哺乳動物細胞表達蛋白，細胞的選擇培養也不可忽視。常用的有中國倉鼠卵巢細胞（CHO）和人胚腎細胞（HEK293）。德泰生物主要培養HEK293用于哺乳動物細胞瞬時轉染，CHO細胞用于穩定轉染。穩定轉染通過穩定細胞系構建篩選出能夠穩定表達的細胞株。針對瞬時轉染，外源基因在短時間轉錄翻譯得到的蛋白量少，1mg質粒得到1mg蛋白，能夠滿足小量蛋白制備，大量生產成本很高。穩定轉染的是將外源基因整合到細胞自身的基因組上，隨著細胞的生長分裂外源基因可以穩定表達，同時經過抗生素加壓篩選，終得到能夠穩定表達蛋白的細胞株。

穩定轉染過程

1.細胞復蘇

細胞復蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細胞株解凍并重新培養的過程。細胞復蘇的關鍵是快復，防止在解凍過程中，產生的水珠形成冰晶損傷細胞。細胞復蘇一般步驟如下：

1）預先加熱水浴鍋，溫度37-40℃，并在離心管中準備好10ml培養基

2）從液氮罐或冰箱中取出細胞，迅速放進預熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動，使其受熱均勻

3）當凍存管內*融化時，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有10ml培養基的離心管中

4）離心5min，去除上清，得到沉淀

5）用培養基懸浮沉淀，并接種到培養瓶常規培養

細胞復蘇后，生長一段時間，95%的細胞貼壁生長，細胞狀態良好，說明細胞復蘇成功。

2.瞬時轉染

以Lipofectamine轉染試劑為例的操作流程，不同轉染試劑參考說明書

1）將復蘇后常規培養的細胞按照1-3x10^5接種到6孔板中，加入2-4ml的*培養基，混勻放置在二氧化碳培養箱中37℃過夜

2）無菌狀態下配置如下溶液：a 用100ul的無血清培養基稀釋2ug的待轉染的質粒

b 用100ul的無血清培養基稀釋25ul的Lipofectamine轉染試劑（血清的存在會影響轉染效率，因此要使用無血清培養基轉染）

3）將ab溶液混合并搖勻，室溫下放置30min左右

4）細胞培養80%單層左右，用無血清培養基洗滌細胞2次，每孔加入1ml的無血清培養基，并將混合后的ab溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，二氧化碳培養箱中37℃培養24小時

5）將轉染液倒出，換為*培養基繼續培養

3.穩定細胞系篩選

24-72h加入選擇性抗生素篩選穩定細胞株，預實驗確定抗生素的濃度，確定抗生素對所選細胞的低作用濃度。

1）提前一天接種細胞與24孔板中，待第二天長成25%單層為宜，二氧化碳培養箱中37℃過夜培養。

2）第二天將培養液換成含抗生素的培養基，抗生素濃度按梯度遞增（0,50,100,200,400,800，1000ug/ml）。

3）培養15天左右絕大多數細胞死亡抗生素濃度為準，一般為400-800ug/ml，篩選細胞時刻適當提高濃度

4）二氧化碳培養箱中37℃培養72h后按照1:10的比例將轉染細胞傳代，使用預實驗得到的抗生素濃度的培養基培養。后挑選單克隆，有限稀釋法挑取單克隆。

 有限稀釋法：將細胞消化下來做連續的10倍稀釋，每稀釋一梯度都在9孔板中培養，生長一周左右再次挑取單克隆進行培養，如此反復3次。

5）Western blot或ELISA檢測蛋白的表達情況，挑取多個單克隆進行表達檢測，篩選出表達量的克隆傳代并保存。

終篩選出穩定高表達目的基因的細胞株，相對于瞬時轉染穩定細胞系構建節約大量的時間和成本，是滿足活性蛋白大量制備的方法。