單細(xì)胞的分離制備與提取擴(kuò)增

　　細(xì)胞是生物學(xué)的基本單位，研究人員正更加努力地嘗試將它們進(jìn)行單個(gè)分離、研究和比較。更大更復(fù)雜的人類細(xì)胞基因組。隨著測序成本的大幅度下降，破譯來自單細(xì)胞的30億堿基的基因組并逐個(gè)細(xì)胞比較序列正在變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。
 

　　目前，最常見的單細(xì)胞測序的應(yīng)用是在腫瘤研究上。來自美國和英國的研究人員近日利用單細(xì)胞基因組擴(kuò)增、測序和裝配，從海洋樣本中鑒定出一個(gè)單細(xì)胞細(xì)菌。
 

　　單細(xì)胞測序方法即single cell sequencing(SNS)，能準(zhǔn)確定量一個(gè)單細(xì)胞核中基因拷貝數(shù)目。由于癌細(xì)胞中基因組部分被刪除，或者擴(kuò)增，從而引起關(guān)鍵基因的缺失，或者表達(dá)過量，干擾正常細(xì)胞生長，因此利用這種方法就能分析基因拷貝數(shù)目，從而診斷。
 

　　單細(xì)胞的分離：
 

　　單細(xì)胞測序的第一步是將目的細(xì)胞從樣本中分離出，目前主要的技術(shù)包括梯度稀釋法、顯微操作技術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選、 微流控技術(shù)和激光捕獲顯微切割。
 

　　單個(gè)細(xì)胞中的DNA和RNA含量無法達(dá)到測序要求，需要對其進(jìn)行擴(kuò)增：
 

　　目前分為單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(WGA)是通過將單個(gè)細(xì)胞溶解得到微量基因組 DNA 進(jìn)行高效地?cái)U(kuò)增，獲得高覆蓋度的單細(xì)胞基因。常用的技術(shù)為有多重置換擴(kuò)增技術(shù)(MDA)。MDA 技術(shù)是在恒溫下利用具有強(qiáng)模板結(jié)合的 phi29DNA 聚合酶和六聚物進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是樣本無需純化，操作簡單，產(chǎn)生的 DNA 片段長，錯(cuò)誤率低，有著良好的 DNA 擴(kuò)增覆蓋效果，缺點(diǎn)是起始模板量低時(shí)擴(kuò)增偏差性大。