如何利用流式進(jìn)行細(xì)胞凋亡（Cell Apoptosis）分析

磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)是一種細(xì)胞膜活性物質(zhì)，正常細(xì)胞中，其位于細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè),在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面。

凋亡早期：磷脂膜(PS)外翻，但是細(xì)胞膜保持完整性，因此PI（與DNA結(jié)合）染色為陰性。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，可以與凋亡早期外翻的磷脂膜(PS)結(jié)合。

凋亡中晚期：磷脂膜(PS)外翻，但是細(xì)胞膜被破壞，Annexin V和PI分別與磷脂酰絲氨酸和DNA結(jié)合。

壞死細(xì)胞：沒有細(xì)胞膜，PI與DNA結(jié)合。

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

FITCAnnexin V Apoptosis Detection Kit I

二、樣本設(shè)置：

1. 空白對(duì)照：輔助判斷管，即不加Annexin V/PI，但用它調(diào)電壓的話，電壓偏高，即根據(jù)它確定的陰陽(yáng)性界限是偏低的。

2. 陰性對(duì)照：未誘導(dǎo)的，Annexin V/PI雙染，細(xì)胞絕大部分都在雙陰性區(qū)域，用它來(lái)確定兩熒光通道的電壓，這是為了排除非特異性結(jié)合。

3. 單陽(yáng)樣本：誘導(dǎo)凋亡，Annexin V單染，用來(lái)調(diào)補(bǔ)償。

4. 單陽(yáng)樣本：誘導(dǎo)凋亡，PI單染，用來(lái)調(diào)補(bǔ)償。

三、實(shí)驗(yàn)步驟：

1.收集細(xì)胞，用冷的PBS洗兩次，之后用1X binding buffer （PBS稀釋）重懸細(xì)胞（1X10^6/ml）;

2.吸取100ul細(xì)胞懸浮液放入新的離心管中，：1）PITC和PI都不染的細(xì)胞 2）只染FITC Annexin V(no PI) 3）只染PI(no FITC Annexin) 4）都染的細(xì)胞（FITC和PI都加5ul）

3.輕輕震蕩混勻，黑暗處室溫（25℃）孵育15mins；

4.最后加入400ul 1X binding buffer,一個(gè)小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

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