WB實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題有哪些？如何解決？

Western Blot雖是實(shí)驗(yàn)室zui常用的蛋白分析技術(shù)，但是由于它步驟繁瑣、操作流程長(zhǎng)、影響因素多，所以導(dǎo)致在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)遇到各式各樣的問(wèn)題，那么你知道WB實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題有哪些呢？該如何解決呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、目標(biāo)條帶沒(méi)有信號(hào)

原因分析：

1.樣品中可能含有蛋白酶，使蛋白樣品分解成小分子。

2.目標(biāo)蛋白濃度過(guò)低（低于檢測(cè)下線）。

3.轉(zhuǎn)膜時(shí)間太短導(dǎo)致目標(biāo)蛋白沒(méi)有充分轉(zhuǎn)移到膜上，或者轉(zhuǎn)膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致樣品轉(zhuǎn)穿。

4.一抗的特異性不佳，導(dǎo)致一抗無(wú)法識(shí)別目標(biāo)蛋白。

解決方法：

1.添加蛋白酶抑制劑。

2.加大上樣量或提高目標(biāo)蛋白濃度。

3.控制轉(zhuǎn)膜時(shí)間并選擇適合的轉(zhuǎn)印膜。

4.選用高品質(zhì)抗體。

二、圖片背景過(guò)高，難以分辨條帶

原因分析：

1.一抗?jié)舛忍撸瑢?dǎo)致抗體非特異性結(jié)合。

2.洗膜的時(shí)間和次數(shù)不夠，導(dǎo)致其他蛋白沒(méi)有清洗干凈

3.封閉物用量不足。

4.封閉物使用不當(dāng)。

解決方法：

1.降低一抗?jié)舛取?/p>

2.提高洗脫時(shí)間和頻率。

3.提高封閉物濃度，孵育時(shí)保證封閉液wan全浸沒(méi)轉(zhuǎn)印膜。

4.檢測(cè)生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉。

三、 膜上出現(xiàn)黑點(diǎn)和黑斑

原因分析：

1.抗體與封閉試劑反應(yīng)。

2.HRP偶聯(lián)二 抗中有聚集體。

解決方法：

1.使用前過(guò)濾封閉試劑。

2.過(guò)濾二抗試劑，去除聚集體。

四、出現(xiàn)非特異性條帶

原因分析：

1.一抗非特異性與蛋白結(jié)合，此種情況大多數(shù)情況是因?yàn)橐豢固禺愋圆缓谩?/p>

2.目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)，有些一抗還能結(jié)合其他蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。

3.蛋白樣品降解，蛋白酶將目標(biāo)蛋白分解成若千個(gè)蛋白，而這些蛋白同樣可以被一抗識(shí)別。

解決方法：

1.更換一抗。

2.更換一抗品種。

3.添加蛋白酶抑制劑。

五、條帶粘連

條帶粘連是不同孔目標(biāo)條帶連在一起，中間無(wú)間隔，如圖所示。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是上樣量太多，或者是制膠問(wèn)題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔。可通過(guò)減少上樣量和提高配膠質(zhì)量來(lái)避免該問(wèn)題。其次是樣品彌散（比如電泳長(zhǎng)時(shí)間停止樣品彌散）

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