WB實驗常見問題有哪些？如何解決？

Western Blot雖是實驗室zui常用的蛋白分析技術，但是由于它步驟繁瑣、操作流程長、影響因素多，所以導致在實驗過程中會遇到各式各樣的問題，那么你知道WB實驗常見問題有哪些呢？該如何解決呢？讓我們一起來看看吧！

一、目標條帶沒有信號

原因分析：

1.樣品中可能含有蛋白酶，使蛋白樣品分解成小分子。

2.目標蛋白濃度過低（低于檢測下線）。

3.轉膜時間太短導致目標蛋白沒有充分轉移到膜上，或者轉膜時間過長導致樣品轉穿。

4.一抗的特異性不佳，導致一抗無法識別目標蛋白。

解決方法：

1.添加蛋白酶抑制劑。

2.加大上樣量或提高目標蛋白濃度。

3.控制轉膜時間并選擇適合的轉印膜。

4.選用高品質抗體。

二、圖片背景過高，難以分辨條帶

原因分析：

1.一抗濃度太高，導致抗體非特異性結合。

2.洗膜的時間和次數不夠，導致其他蛋白沒有清洗干凈

3.封閉物用量不足。

4.封閉物使用不當。

解決方法：

1.降低一抗濃度。

2.提高洗脫時間和頻率。

3.提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液wan全浸沒轉印膜。

4.檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉。

三、 膜上出現黑點和黑斑

原因分析：

1.抗體與封閉試劑反應。

2.HRP偶聯二 抗中有聚集體。

解決方法：

1.使用前過濾封閉試劑。

2.過濾二抗試劑，去除聚集體。

四、出現非特異性條帶

原因分析：

1.一抗非特異性與蛋白結合，此種情況大多數情況是因為一抗特異性不好。

2.目的蛋白有多個修飾位點，有些一抗還能結合其他蛋白的結合位點。

3.蛋白樣品降解，蛋白酶將目標蛋白分解成若千個蛋白，而這些蛋白同樣可以被一抗識別。

解決方法：

1.更換一抗。

2.更換一抗品種。

3.添加蛋白酶抑制劑。

五、條帶粘連

條帶粘連是不同孔目標條帶連在一起，中間無間隔，如圖所示。出現該現象的原因可能是上樣量太多，或者是制膠問題，分離膠和濃縮膠之間有間隙，樣品竄孔。可通過減少上樣量和提高配膠質量來避免該問題。其次是樣品彌散（比如電泳長時間停止樣品彌散）

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