逆轉(zhuǎn)錄酶怎么選？

　　逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)是一種用于從RNA模板生成互補(bǔ)DNA(cDNA)的酶，是cDNA合成和RT-qPCR反應(yīng)中的核心酶，其合成的cDNA可以直接作為PCR,qPCR，LAMP和測(cè)序等檢測(cè)的模板。那么你知道該如何選擇逆轉(zhuǎn)錄酶嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

　　一、逆轉(zhuǎn)錄酶活性

　　逆轉(zhuǎn)錄酶主要包括以下三種活性：

　　①逆轉(zhuǎn)錄活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合，生成DNA-RNA雜合雙鏈。

　　②RNase H活性：水解雜合雙鏈中的RNA，得到與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈（cDNA）。

　　③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性：以cDNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成雙鏈DNA。

　　二、決定最佳逆轉(zhuǎn)錄酶的幾個(gè)關(guān)鍵重要特性

　　1.熱穩(wěn)定性

　　耐高溫能力是cDNA合成的一個(gè)重要方面，因?yàn)楦邷赜兄谑咕哂袕?qiáng)二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或高GC含量的RNA變性，從而實(shí)現(xiàn)全長(zhǎng)cDNA合成和更高產(chǎn)量。

　　野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在37°C下表現(xiàn)最佳，而加工改造后的熱穩(wěn)定性MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可以承受高達(dá)55°C的溫度，而不會(huì)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄效率產(chǎn)生負(fù)面影響。

　　2.RNase H活性

　　RNase H(核糖核酸酶H)是一種切割并降解RNA-DNA雜交鏈中RNA鏈的酶，同時(shí)可以保持DNA鏈的完整。

　　如果逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性過(guò)高，則會(huì)導(dǎo)致RNA模板的過(guò)度降解，引起cDNA合成不完整或效率低下。具有低RNase H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶可以最大限度地減少反應(yīng)中RNA分子的非特異性降解，提高cDNA合成的特異性和保真度。

　　由于RNA模板在全長(zhǎng)逆轉(zhuǎn)錄完成之前可能被降解，RNase H活性是長(zhǎng)片段cDNA合成過(guò)程中需要規(guī)避的因素。RNase H活性還可能會(huì)與逆轉(zhuǎn)錄酶中的活性聚合酶競(jìng)爭(zhēng)從而降低逆轉(zhuǎn)錄效率。為了更好地合成cDNA，通過(guò)在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H結(jié)構(gòu)域中引入突變，逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性降低甚至完q消除。這種突變常常可以增加長(zhǎng)鏈cDNAs的產(chǎn)量，促進(jìn)其合成。

　　3.持續(xù)合成能力

　　持續(xù)合成能力是指在酶的單個(gè)結(jié)合事件中摻入的核苷酸數(shù)量。持續(xù)合成能力強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄酶可以在更短的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)合成更長(zhǎng)的cDNA鏈。大多數(shù)經(jīng)過(guò)改造的逆轉(zhuǎn)錄酶具有更強(qiáng)的合成能力(比野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶高65倍)。

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