PCR實驗的七大要素

　　PCR是一種能夠在短時間內(nèi)將單個DNA分子擴增數(shù)百萬倍的生化過程。其擴增過程包括三個連續(xù)步驟：變性，對雙鏈DNA模板進行加熱，使其解離；退火，被稱為引物的短DNA分子與目標DNA的側翼區(qū)域結合；延伸，DNA聚合酶沿著模板鏈將引物3’端進行延伸。多年以來，PCR的基本原理一直未變，但隨著 DNA聚合酶和試劑性能的大幅提升，以及儀器和塑料反應管的不斷創(chuàng)新，PCR實驗方法也在不斷改進。那么你知道PCR實驗的七大要素嗎？讓我們一起來看看吧！
 

　　一、DNA聚合酶
 

　　DNA聚合酶是PCR的重要組成部分，它們能夠從單鏈DNA模板合成新的互補鏈。所有DNA聚合酶都具有5′→ 3′聚合酶活性，即摻入核苷酸并使引物從按5'至3’方向延伸。
 

　　早期的PCR，通常使用來源于 大腸桿菌 的DNA聚合酶I上的 Klenow片段 來生成新的子鏈。但是，這種 大腸桿菌酶對熱敏感，易受到變性階段高溫度的破壞，從而無法繼續(xù)進行退火和延伸步驟。因此，需要在全程每個循環(huán)的退火步驟中重新補充酶。
 

　　二、熱循環(huán)儀
 

　　熱循環(huán)儀是一種能夠為PCR反應自動完成溫度循環(huán)和孵育的儀器。在引入熱循環(huán)儀之前，PCR反應是一個費時費力的過程，需在不同溫度的水浴之間轉移樣品，并為每個步驟需要精確定時。
 

　　三、模板DNA
 

　　用于復制的PCR模板可以是任何DNA來源，如基因組DNA(gDNA)、互補DNA(cDNA)和質(zhì)粒DNA。
 

　　四、引物
 

　　PCR引物是含有15-30個堿基的合成DNA寡核苷酸。能夠與模板DNA中目標區(qū)域的側翼序列結合(通過序列互補)。在PCR反應期間，DNA聚合酶從 3′端開始延伸引物。因此，引物結合位點必須是靶標附近所有的，并且與起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以確保目的片段的特異性擴增。
 

　　五、脫氧核苷三磷酸(dNTP)
 

　　dNTP由四個基本核苷酸組成——dATP、dCTP、dGTP和dTTP——是新DNA鏈的組成元件。這四種核苷酸通常以相等摩爾量加入到PCR反應體系中，以實現(xiàn)最佳的堿基引入。但是，在某些情況下，如通過PCR方法進行隨機突變，偶爾也會使用濃度不等的dNTP，以促進非校正DNA聚合酶產(chǎn)生更多的錯誤堿基插入。
 

　　六、鎂離子(Mg2+ )
 

　　鎂離子(Mg2+ )作為DNA聚合酶活性的輔助因子，有助于聚合期間dNTP的結合。酶活性位點處的鎂離子可催化引物的3′-OH與dNTP的磷酸基團間形成磷酸二酯鍵。此外， Mg2+  能夠穩(wěn)定磷酸鹽骨架上的負電荷，從而促進引物與DNA模板形成復合物
 

　　七、緩沖液
 

　　PCR緩沖液能夠為DNA聚合酶活性提供適宜的化學環(huán)境。緩沖液pH通常為8.0-9.5，一般使用Tris-HCl來調(diào)節(jié)。
 

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