常見(jiàn)的膜蛋白提取方法

　　細(xì)胞膜是一種特殊生物膜，不僅保證了細(xì)胞內(nèi)各種生理反應(yīng)有序進(jìn)行，也實(shí)現(xiàn)了物質(zhì)、能量和信號(hào)的正常傳導(dǎo)，其大部分功能依靠細(xì)胞膜上的膜蛋白完成。膜蛋白提取的難點(diǎn)較多，主要原因是膜蛋白在生物體內(nèi)的表達(dá)水平較低，具有強(qiáng)的疏水特性，并且通常在實(shí)驗(yàn)條件下難以維持正確構(gòu)象。下面讓我們一起來(lái)看看常見(jiàn)的膜蛋白提取方法都有什么吧！

　　一、先分離膜，然后提取

　　如選用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細(xì)胞破碎，然后通過(guò)剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。

　　（例如：michael11液氮研磨組織→加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑→差速離心→蔗糖密度梯度離心→收集37%與41%間的成分，即為質(zhì)膜部分→裂解即可收集膜蛋白）。

　　二、用特殊的去污劑選擇性的分離

　　采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來(lái)，然后將蛋白質(zhì)穩(wěn)定。去垢劑的選擇通常是依據(jù)對(duì)所需要蛋白質(zhì)的提取效率來(lái)確定，但在某些情況下，還要考慮到以后的純化步驟。雖然許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進(jìn)行純化，但最終仍可能需要除去去垢劑。在設(shè)計(jì)膜蛋白溶解方案時(shí)，必須考慮某一去垢劑的特殊性質(zhì)。如tritonX-100在280nm處有吸收，如果某蛋白質(zhì)的測(cè)試與280 nm處的吸收有關(guān)，就應(yīng)避免使用這類去垢劑。將膜制劑與胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞核分離后，再進(jìn)一步從細(xì)胞膜制劑中將所需的膜蛋白增溶下來(lái)。這種做法的好處是可以用強(qiáng)烈的去垢劑提取細(xì)胞骨架的相關(guān)蛋白，而無(wú)需考慮胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核成分或染色質(zhì)成分的混入。使用這種方法所獲得的膜蛋白，無(wú)論在種類上還是數(shù)量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（＜5000 Da）要多。

　　一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白總量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，無(wú)疑對(duì)于研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都是非常重要的。第二種方法簡(jiǎn)單，可靠，但有時(shí)含有其他蛋白。一般的都是利用4度時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX-114水溶液，在溫度超過(guò)20度時(shí)，此溶液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。利用此性質(zhì)可提取膜蛋白。

　　三、膜蛋白色譜（CMP）

　　CMP+分離強(qiáng)疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(tuán)（P-端），又具有陽(yáng)離子鈣（C-端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量有關(guān)。利用原子散射法研究cAMP的分離機(jī)制發(fā)現(xiàn)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達(dá)到分級(jí)分離的目的。

　　四、離心柱法提取膜蛋白

　　高滲的蛋白裂解液讓細(xì)胞溶漲破裂后，超高速離心。

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