一步法RT-qPCR實(shí)驗(yàn)優(yōu)化小技巧

常見的RT-qPCR流程一般分為RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR三個(gè)步驟，當(dāng)有的課題需要對(duì)某物種進(jìn)行多種處理后，檢測(cè)某個(gè)基因的表達(dá)水平，以驗(yàn)證該基因應(yīng)對(duì)不同脅迫壓力的耐受力；或者經(jīng)某種病原菌侵染后，檢測(cè)寄主不同基因的表達(dá)水平，以探究可能涉及的通路及互作機(jī)理等……對(duì)于這幾類樣本數(shù)量較大，但樣本只需要檢測(cè)一次的實(shí)驗(yàn)方案，我們常常推薦一步法RT-qPCR，即逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR配制一管體系，只需一次上機(jī)即可完成表達(dá)量的檢測(cè)。

由于將RNA逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR的體系配制合為一步，那么對(duì)于實(shí)驗(yàn)操作的精準(zhǔn)度及污染控制就極為重要，針對(duì)一步法RT-qPCR的特殊性，以下總結(jié)了一步法RT-qPCR實(shí)驗(yàn)優(yōu)化小技巧可有效提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。

1. 目的片段選擇

①　選擇80-200 bp擴(kuò)增子可保證PCR擴(kuò)增效率zui大化

②　片段GC含量建議控制在40% ~ 60%

③　避免擴(kuò)增子與模板其他位置出現(xiàn)長(zhǎng)片段的重復(fù)序列

④　避免擴(kuò)增子出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)

2. RNA模板制備

①　盡量選擇高產(chǎn)量、高純度的RNA提取試劑

②　RNA可以保存在含有EDTA溶液 (1 × TE) 中，EDTA可螯合金屬離子來消除對(duì)RNase的催化作用，以此保證RNA的完整性

③　RNA提取后可以使用DNase I (ATG #E103) 消化基因組DNA殘留

3. 引物設(shè)計(jì)

①　常規(guī)引物長(zhǎng)度15-30 nt，理想的引物GC含量40-60%，Tm值盡量接近60℃，且上下游引物Tm值相差盡量3℃以內(nèi)，避免4個(gè)重復(fù)性的堿基序列，尤其是4個(gè)G堿基

②　引物濃度按說明書推薦值添加，引物投入量過多，可能產(chǎn)生引物二聚體或非特異擴(kuò)增，熔解曲線會(huì)出現(xiàn)雜峰

③　以cDNA為模板時(shí)，建議引物區(qū)域跨越內(nèi)含子，這樣減少以基因組DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增的假陽性

4. 探針設(shè)計(jì)

①　常規(guī)探針長(zhǎng)度15-30 nt，以保證熒光基團(tuán)能夠有效猝滅，GC含量保持40-60%

②　一般情況下，非熒光猝滅基團(tuán)比熒光猝滅基團(tuán)更有信噪比

③　避免5’端為G堿基，否則會(huì)猝滅熒光基團(tuán)

④　設(shè)計(jì)的探針應(yīng)該結(jié)合到正義鏈或反義鏈上

⑤　一般探針Tm值要比引物Tm值高5-10℃，保證引物結(jié)合前探針的全部序列與模板充分結(jié)合

5. 多重?cái)U(kuò)增

①　避免探針、引物之間及目的序列之間沒有重疊序列

②　設(shè)計(jì)探針時(shí)，保證每個(gè)目的序列有唯yi的用于檢測(cè)的熒光基團(tuán)

③　根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)范圍來選擇熒光基團(tuán)，熒光報(bào)告基團(tuán)的發(fā)射光譜不能有重疊

④　在單重反應(yīng)中檢測(cè)每一組引物/探針組合，以設(shè)置一個(gè)基線標(biāo)準(zhǔn)，確保在多重PCR時(shí)Ct值接近

⑤　高豐度目的序列可搭配低強(qiáng)度熒光染料，低豐度目的序列則搭配高強(qiáng)度熒光染料

6. 逆轉(zhuǎn)錄

①　一般建議逆轉(zhuǎn)錄這一步的反應(yīng)溫度按照試劑說明書設(shè)置，對(duì)于具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域的模板，建議提高反應(yīng)溫度，有助于提升擴(kuò)增效率和靈敏度。

7. 循環(huán)條件

①　一般情況下，按照說明書中的循環(huán)條件即可達(dá)到最佳效果

②　可以進(jìn)行較長(zhǎng)片段擴(kuò)增 (>400 bp)，但可能需要優(yōu)化延伸時(shí)間

③　對(duì)于大多數(shù)情況，40個(gè)循環(huán)是足夠的，極低起始量的可以進(jìn)行45個(gè)循環(huán)

8. 建立反應(yīng)

①　為了達(dá)到最佳結(jié)果，在熱循環(huán)之前請(qǐng)將反應(yīng)體系放在冰上

②　對(duì)于96孔板，推薦使用20 μl反應(yīng)體系。使用384孔板，推薦10 μl反應(yīng)體系

③　每一個(gè)樣本應(yīng)設(shè)置三個(gè)重復(fù)，保證每一個(gè)擴(kuò)增子包含陰性對(duì)照 (NTC)

④　為了避免交叉污染，熱循環(huán)前加入熱敏UDG，37℃處理10 min

9. 檢測(cè)評(píng)估

①　確保至少三個(gè)10倍梯度稀釋模板的擴(kuò)增效率達(dá)到90-110%，相關(guān)系數(shù)（R2) 應(yīng)>0.99

②　通過產(chǎn)物的長(zhǎng)度、測(cè)序或熔解曲線分析確認(rèn)其特異性

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