蛋白表達(dá)的常見(jiàn)問(wèn)題

　　蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的時(shí)，有時(shí)候?qū)嶒?yàn)會(huì)覺(jué)得參考實(shí)驗(yàn)方法和克隆的蛋白基因序列完q沒(méi)有問(wèn)題，但蛋白電泳就是沒(méi)有結(jié)果。那么你知道蛋白表達(dá)的常見(jiàn)問(wèn)題有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

　　1、載體構(gòu)建錯(cuò)誤，很多克隆新人常常弄錯(cuò)讀碼框。比如Qiagen的pQE系列載體，其復(fù)制位點(diǎn)常有一兩個(gè)堿基的差異；另外有些酶產(chǎn)生粘端有些酶產(chǎn)生平端，這些都容易導(dǎo)致讀碼框錯(cuò)誤，從而無(wú)法表達(dá)出來(lái)。

　　2、宿主菌選擇不當(dāng)。不同的宿主菌其基因型是不同的。有些經(jīng)過(guò)特殊修飾的載體，或者特殊用途的載體，或者有特殊啟動(dòng)子的載體，必須選擇適合的宿主菌進(jìn)行表達(dá)。因此，當(dāng)你的蛋白沒(méi)有表達(dá)出來(lái)時(shí)，可以考慮更換宿主菌。

　　3、密碼子的使用頻率較低。有些基因其本身含有許多罕見(jiàn)密碼子，尤其是起始密碼之后的15個(gè)堿基之內(nèi)的罕見(jiàn)密碼子，對(duì)蛋白表達(dá)有著很重要的影響。優(yōu)化密碼子對(duì)原核表達(dá)似乎效果很好，對(duì)真核表達(dá)系統(tǒng)未必有很好的效果。

　　4、質(zhì)粒不穩(wěn)定或者質(zhì)粒丟失。pET系統(tǒng)通常相對(duì)較穩(wěn)定。但是你選用帶氨芐青霉素抗性的載體時(shí)，也許有可能產(chǎn)生β-lactamase降解了抗生素，使質(zhì)粒丟失。還有一種情況是表達(dá)重組的毒素蛋白，對(duì)宿主細(xì)胞也具有毒性，導(dǎo)致質(zhì)粒丟失。這種情況在真核表達(dá)系統(tǒng)中較為常見(jiàn)。

　　5、蛋白酶將蛋白降解了。這種情況通常由重組蛋白本身的N-或C-端序列引起。當(dāng)?shù)鞍譔-端是Arg,Leu,Lys,Phe,Trp,或Tyr這些氨基酸時(shí)，容易受到蛋白酶降解，這就是所謂的N-末端規(guī)則。如果N-端是Met時(shí)，大腸桿菌可以偷偷地將這個(gè)Met去掉，尤其是Met之后緊跟著一個(gè)帶有小側(cè)鏈的氨基酸時(shí)。而C-末端存在非極性氨基酸時(shí)，也容易導(dǎo)致蛋白被降解。如果C末端最后5個(gè)氨基酸是極性的或者帶電荷的，則不容易被降解。

　　6、二級(jí)翻譯起始位點(diǎn)。這種情況出現(xiàn)在你的序列中恰好包含與核糖體結(jié)合位點(diǎn)完q相同的序列。那就怪不得了，核糖體會(huì)非常高興地找到這個(gè)位點(diǎn)，然后開(kāi)始翻譯，導(dǎo)致你的蛋白被截短，在電泳時(shí)無(wú)法看到預(yù)期大小的片段。

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